Подходы к изоляции мезенхимальных стволовых клеток из мышц древней лошади для предупреждения грибковой контаминации

Останки древних животных с мягкими тканями хранят в себе ценную информацию об эволюции и вымирании этих видов. Одним из наиболее уникальных находок ископаемых останков животных плейстоценового периода является полная туша новорожденного жеребенка ленской лошади, вытаявшая в июне 2018 г. в Батагайской котловине Верхоянского района Якутии. По сохранности мягких тканей эта находка, по общему мнению участвующих в исследовании специалистов, является лучшей за всю историю палеонтологии. Сохранились не только все внутренние органы, но и жидкая кровь и продукты метаболизма в жидком нативном состоянии. Нами была проведена изоляция стволовых клеток для попыток клонирования этого вымершего вида лошади. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются потенциальными донорами клеток для терапевтического клонирования (переноса ядра соматической клетки) и геномного протеомного анализа. Однако многие тысячелетия нахождения туши древней лошади в условиях многолетней мерзлоты привели к грибковой контаминации тканей, из-за которой попытки получить первичную культуру клеток лошади были неудачными. Была установлена стратегия для предотвращения грибковой контаминации при изоляции МСК. Обработка разными концентрациями амфотерицина Б показала, что при концентрации 2,5 мг/мл амфотерицин Б проявляет наибольшую эффективность для предотвращения грибковой контаминации. Также был проведен анализ контаминаций в условиях тканевой культуры и условиях культуры из отдельных клеток. Эта оценка доказала, что система культивирования отдельных клеток в значительной степени была защищена от грибковой контаминации изолированных МСК. Результат предполагает его практическое использование для первичной культуры древних животных in vitro для предупреждения грибковой контаминации.

древняя лошадь, мезенхимальная стволовая клетка, перенос ядра соматической клетки, долговременное сохранение, мышечная ткань, грибковая контаминация, амфотерицин Б, культура из отдельных клеток, культура прикрепления тканей, система первичной культуры клеток

1. Webb Miller, Daniela I. Drautz, Aakrosh Ratan, Barbara Pusey, Ji Qi, Arthur M. Lesk, Lynn P. Tomsho, Michael D. Packard, Fangqing Zhao, Andrei Sher, Alexei Tikhonov, Brian Raney, Nick Patterson, Kerstin Lindblad-Toh, Eric S. Lander, James R. Knight, Gerard P. Irzyk, Karin M. Fredrikson, Timothy T. Harkins, Sharon Sheridan, Tom Pringle, Stephan C. Schuster. Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth // Nature, 2008 456:387-390.

2. Eleftheria Palkopoulou, Swapan Mallick, Pontus Skoglund, Jacob Enk, Nadin Rohland, Heng Li, Ayca Omrak, Sergey Vartanyan, Hendrik Poinar, Anders Gotherstrom, David Reich, Love Dalen. Complete Genomes Reveal Signatures of Demographic and Genetic Declines in the Woolly Mammoth // Current Biology, 2015 25(10):1395-1400.

3. Poinar H. N., Schwarz C., Qi J., Shapiro B., Macphee R. D., Buigues B., Tikhonov A., Huson D. H., Tomsho L. P., Auch A., Rampp M., Miller W., Schuster S. C. Metagenomics to paleogenomics: large-scale sequencing of mammoth DNA // Science 2006 311(5759):392-394.

4. S. E. Grigoriev, M. Yu. Cheprasov, G. N. Savvinov, A. N. Tikhonov, G. P. Novgorodov, S. E. Fedorov, G. G. Boeskorov, A. V. Protopopov, V. V. Plotnikov, I. N. Belolubsky, K. E. Protodiyakonov, J. van der Plicht. Paleontological and Archaeozoological Researches in the Yana River Basin // Vestnik Severo-Vostochnogo federal'nogo universiteta im. M.K. Ammosova. - 2017. - №. 1 (57).

5. Plasteeva N. A., Klement'ev A. M. Pozdneplejstocenovaja loshad' Equus (Equus) ferus (Perissodactyla, Equidae) Pribajkal'ja i Zabajkal'ja //Trudy Zoologicheskogo instituta RAN. - 2017. - T. 321. - №. 2. - PP. 180-198.

6. Vasilieva S. Cloning of extinct animals // O Rossii s ljubov'ju. Liki Materials of the II international interuniversity forum. - 2017. - PP. 377-380.

7. Kazuo Yamagata, Kouhei Nagai, Hiroshi Miyamoto, Masayuki Anzai, Hiromi Kato, Kei Miyamoto, Satoshi Kurosaka, Rika Azuma, Igor I. Kolodeznikov, Albert V. Protopopov, Valerii V. plotnikov, Hisato Kobayashi, Ryouka Kawahara-Miki, Tomohiro Kono, Masao Uchida, Yasuyuki Shibata, Tetsuya Handa, Hiroshi Kimura, Yoshihiko Hosoi, Tasuku Mitani, Kazuya Matsumoto & Akira Iritani. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging // Scientific Reports. - vol. 9. - 2019, Article number: 4050.

8. Pablo Librado, Clio Der Sarkissian, Luca Ermini, Mikkel Schubert, Hákon Jónsson, Anders Albrechtsen, Matteo Fumagalli, Melinda A Yang, Cristina Gamba, Andaine Seguin-Orlando, Cecilie D Mortensen, Bent Petersen, Cindi A. Hoover, Belen Lorente-Galdos, Artem Nedoluzhko, Eugenia Boulygina, Svetlana Tsygankova, Markus Neuditschko, Vidhya Jagannathan, Catherine Thèves, Ahmed H Alfarhan, Saleh A Alquraishi, Khaled A. S. Al-Rasheid, Thomas Sicheritz-Ponten, Ruslan Popov, Semyon Grigoriev, Anatoly N Alekseev, Edward M. Rubin, Molly McCue, Stefan Rieder, Tosso Leeb, Alexei Tikhonov, Eric Crubézy, Montgomery Slatkin, Tomas Marques-Bonet, Rasmus Nielsen, Eske Willerslev, Juha Kantanen, Egor Prokhortchouk, Ludovic Orlando. Tracking the origins of Yakutian horses and the genetic basis for their fast adaptation to subarctic environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - Volume 112. - Issue 50. - 15 December 2015. - PР. E6889-E6897

9. Savvina L. P., Spiridonova M. A. The Yakutian horse is a unique breed in the world // European science forum. - 2019. - PP. 153-157.

10. Ivanov R. V., Alferov I. V., Shahurdin D. N. Nekotorye osobennosti povedenija jakutskih loshadej na pastbishhe // Agrarnaja Rossija. - 2019. - №. 5. - PP. 26-29.

11. Solomonov N. G., Anufriev A. I., Yadrikhinskii V. F., Isaev A. P. Body temperature changes in purebred and hybrid Yakut horses under the conditions of Yakutia // Dokl Biol Sci, 2009 427(1):358-361.

12. Grigoreva N. N., Koryakina L. P. Dynamics of products of a metabolism glycoproteide and activity of enzymes AcAT, AAT at different type the Yakut breed of a horse // Doklady Rossiiskoi Akademii Sel’skokhozyaistvennykh Nauk, 2008 3:44-46.

13. N. N. Spasskaya, O. F. Chernova, and M. V. Ibraev. Microstructural Characteristics of Hair of Pleistocene Mummy of “Bilibino Horse” Equus sp // Moscow University Biological Sciences Bulletin, 2012. - Vol. 67. - No. 1. - pp. 36-41.

14. Olivera R, Moro L. N., Jordan R, Pallarols N., Guglielminetti A., Luzzani C., Miriuka S. G., Vichera G. Bone marrow mesenchymal stem cells as nuclear donors improve viability and health of cloned horses // Stem Cells Cloning. 2018; 11: 13-22.

15. Vidal M. A., Kilroy G. E., Johnson J. R., Lopez M. J., Moore R. M., Gimble J. M. Cell growth characteristics and differentiation frequency of adherent equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity // Vet Surg. 2006;35(7):601-610.

16. Koch T. G., Heerkens T., Thomsen P. D., Betts D. H. Isolation of mesenchymal stem cells from equine umbilical cord blood // BMC Biotechnol. 2007;7:26.

17. Hyun-Chang Park, Young-Bum Son, Sung-Lim Lee, Gyu-Jin Rho, Young-Hoon Kang, Bong-Wook Park, Sung-Hoon Byun, Sun-Chul Hwang, In-Ae Cho, Yeong-Cheol Cho, Iel-Yong Sung, Dong Kyun Woo, June-Ho Byun. Effects of Osteogenic-Conditioned Medium from Human Periosteum-Derived Cells on Osteoclast Differentiation // International journal of medical science, 2017 Nov 2;14(13):1389-1401.

18. Korovina D. G., Yurov K. P., Alexeenkova S. V., Savchenkova E. A., Savchenkova I. P Characterization of multipotent mesenchymal stem cells isolated from equine cord blood // Rossijskaja sel'skohozjajstvennaja nauka (Russian Agricultural Sciences). - 2017. - №. 2. - PP. 51-54.

19. Krivoruchko A. Yu., Belyaev V. A., Nekrasova I. I., Fedota N. V. Experience of cultivation of sheep fibroblasts // Vestnik APK Stavropol’ja - 2013. - №3(11). - PP. 139-141.

20. Olivera R, Moro LN, Jordan R, et al. In vitro and in vivo development of horse cloned embryos generated with ipscs, mesenchymal stromal cells and fetal or adult fibroblasts as nuclear donors // PLoS One, 2016;11(10):e0164049.

21. C. Leifert, J.Y. Ritchie and W.M. Waites. Contaminants of plant-tissue and cell cultures // World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1991, 7. 452469.

22. Hagenah M, Böhnke M, Engelmann K, Winter R. Incidence of bacterial and fungal contamination of donor corneas preserved by organ culture // Cornea. 1995 Jul;14(4):423-6.

23. G. A. Kochkina, N. E. Ivanushkina, S. M. Ozerskaya. The structure of mycobiota in permafrost // Mikologija segodnja. - 2011. - T. 2. - 178-184.

24. Ana C. Mesa-Arango, Liliana Scorzoni and Oscar Zaragoza. It only takes one to do many jobs: Amphotericin B as antifungal and immunomodulatory drug // Front Microbiol. 2012; 3: 286.

25. Chen Y.-J., Liu H.-Y., Chang Y.-T., Cheng Y.-H., Mersmann H. J., Kuo W.-H., Ding S.-T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues // J. Vis. Exp. 2016 doi: 10.3791/53886.

26. Hideya Yoshimura, Takeshi Muneta, Akimoto Nimura, Akiko Yokoyama, Hideyuki Koga, Ichiro Sekiya. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle // cell and tissue research, 2007, Volume 327, Issue 3, pp. 449-462.

27. Sedat Odabas, A. Eser Elçin, Y. Murat Elçin. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stem Cells // Molecular Biology. - 2014. - 1109.

28. Park B. W., Kang E. J., Byun J. H., Son M. G., Kim H. J., Hah Y. S. et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues // Differentiation; research in biological diversity, 2012, 83(5):249-259.

29. Caplan A. I. Mesenchymal Stem Cells: Time to Change the Name! // Stem Cells Transl Med. 2017, Jun;6(6):1445-1451.

30. Nobuaki Ozeki, Makio Mogi, Hideyuki Yamaguchi, Taiki Hiyama, Rie Kawai, Naoko Hase, Kazuhiko Nakata, Hiroshi Nakamura, Randall H. Kramer. Differentiation of Human Skeletal Muscle Stem Cells into Odontoblasts Is Dependent on Induction of 1 Integrin Expression // The Journal of Biological Chemistry, 2014, 289;20;14380-14391.

31. Cristina L. Esteves, Tara A. Sheldrake, Simone P. Mesquita, Juan J. Pesántez, Timothy Menghini, Lucy Dawson, Bruno Péault and F. Xavier Donadeu. Isolation and characterization of equine native MSC populations // Stem Cell Res Ther, 2017; 8: 80.

32. Patricia Gálvez Martín, María Bermejo González, Adolfina Ruiz Martínez, Visitación Gallardo Lara, Beatriz Clares Naveros. Isolation and characterization of the environmental bacterial and fungi contamination in a pharmaceutical unit of mesenchymal stem cell for clinical use // Biologicals, 2012; 40: 5.